Laboratoorsed Tulemused: Polümeraasi Ahelreaktsioon (PCR)

Sisukord:

Laboratoorsed Tulemused: Polümeraasi Ahelreaktsioon (PCR)
Laboratoorsed Tulemused: Polümeraasi Ahelreaktsioon (PCR)

Video: Laboratoorsed Tulemused: Polümeraasi Ahelreaktsioon (PCR)

Video: Laboratoorsed Tulemused: Polümeraasi Ahelreaktsioon (PCR)
Video: Kalle Grünthal: PCR-testimine ja metoodika peab minema seadusesse sisse 2024, Märts
Anonim

Laboratoorsed tulemused: polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on geneetilise materjali peenmolekulaarse struktuuri uurimiseks kõige olulisem laborimeetod. See koosneb deoksüribonukleiinhappest (DNA), mis loob inimese, aga ka loomade ja taimede geneetilise koodi.

Inimmeditsiinis kasutatakse PCR-i pärilike haiguste ja geneetiliste probleemide (haiguse risk, isadustest jne) selgitamiseks, aga ka arvukate nakkushaiguste diagnoosimisel. Erinevalt seroloogilisest diagnostikast (antikehade määramine patogeenide vastu veres) esindavad PCR-meetodid otsest laboratoorset meditsiinilist avastamismeetodit nakkushaiguste selgitamiseks.

PCR eeliseks on ühelt poolt testitulemuste kiire kättesaadavus. Lisaks on PCR-meetodid tavaliselt väga tundlikud.

navigeerimine

  • Jätka lugemist
  • rohkem sel teemal
  • Nõuanded, allalaadimised ja tööriistad
  • Mis on polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) ja mida seda uuritakse?
  • Kuidas PCR töötab?
  • Milliseid testitulemusi PCR annab?
  • Kas tavapärases PCR-is on veel arenguid?
  • Millised on PCR-i peamised kasutusvaldkonnad?
  • Kas PCR-testi tulemuste jaoks on olemas võrdlusväärtused?

See tähendab, et isegi väikseimad patogeeni (bakterid, viirused jne) geneetilise materjali kogused toovad vastava uuritava materjali vastava patogeeni avastamisperioodi jooksul usaldusväärselt positiivse tulemuse. PCR-meetodite uurimismaterjalidena kasutatakse peamiselt verd, aga ka muid kehavedelikke (röga, uriin, vedelik jne).

Mis on polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) ja mida seda uuritakse?

Polümeraasi ahelreaktsioon ("Polymerase Chain Reaction" - PCR) on geneetilise materjali peenmolekulaarse struktuuri uurimiseks kõige olulisem laborimeetod. Sel põhjusel nimetatakse seda uurimismenetlust ka nn

“Molekulaarne diagnostika”

Geneetilise materjali (seda nimetatakse ka "geneetiliseks materjaliks") aluseks on spetsiaalne pika ahelaga molekul:

"DNA" (deoksüribonukleiinhape)

Inimestel paikneb kaheahelalisest DNA-st (kahest komplementaarsest ahelast) koosnev geneetiline materjal kõigi keharakkude tuumas, kusjuures üksikisiku kõigil keharakkudel on identne geneetiline materjal. Lisaks on iga inimese individuaalse geneetilise koostise täpne koostis ainulaadne - võrreldav sõrmejäljega, mis on ka iga inimese jaoks ainulaadne.

Sel põhjusel nimetatakse ka geneetilist materjali

"Geneetiline kood" tähendab seda, et inimese kõigi keha struktuuride plaan on kaardistatud selles krüpteeritud kujul ja salvestatakse sel viisil ja seda saab edasi anda

Keha rakkude rakutuumades on DNA spetsiaalses järjekorras, mida nimetatakse

"Kromosoomid" (pärilikud kehad) nimetatakse. Inimestel esinevad need keharakkudes alati paarikaupa, üks on päritud emalt ja teine isalt. Selles mõttes sisaldavad inimese kõik keharakud kokku 46 kromosoomi - 22 paari nn autosoome ja üks paar nn sugukromosoome

Ühelt poolt saab PCR-i laborimeetodi abil uurida inimese DNA peenstruktuuri, mis on oluline haiguste diagnoosimiseks või konkreetsete küsimuste selgitamiseks:

  • Pärilike haiguste selgitamine,
  • Haiguste riski hindamine,
  • Ainevahetuse sünnipäraste iseärasuste uurimine,
  • kohtuekspertiisi (nn kohtuekspertiisi) analüüs (nt isaduse tõendamine) ja palju muud

Teisest küljest on inimestel mitte ainult vastav geneetiline koostis, vaid tegelikult on kõigil maa vormidel spetsiifiline geneetiline koostis:

  • Loomad,
  • Taimed,
  • Seened,
  • Bakterid,
  • Viirused,
  • Parasiidid jne

Nende eluvormide geneetiline koostis koosneb samuti peamiselt DNA-st või mõne viiruse korral ka RNA-st (ribonukleiinhape), mis erinevalt DNA-st on üheahelaline. Meditsiinidiagnostikas kasutatakse PCR-i seetõttu ka paljude nakkushaiguste selgitamiseks:

  • bakteriaalsed infektsioonid (nt tuberkuloos, bakteriaalsed sugulisel teel levivad haigused),
  • viirusnakkused (nt viirushepatiit, HIV-nakkus),
  • parasiitnakkused (nt malaaria) ja palju muud

Kuidas PCR töötab?

PCR-meetodi töötas välja 1983. aastal Ameerika biokeemik Kary B. Mullis ja see põhineb peamiselt kahel põhimõttel:

  • Geneetilise materjali väikese osa (DNA või RNA) paljundamine ("amplifikatsioon")
  • Amplifikatsiooni korrutatud ("võimendatud") saaduste tuvastamine ja identifitseerimine.

Seetõttu on PCR-i läbiviimiseks vajalikud järgmised komponendid:

  • uuritav materjal (nt vere-, raku- või koeproovid),
  • teatud reagendid ("polümeraas", "praimer", "nukleotiidid" (need on DNA ehitusplokid) jne) ja laboriseadmed geneetilise materjali amplifitseerimiseks
  • PCR-toodete tuvastussüsteem.

PCR-i läbiviimiseks vajalike reaktiivide ja laboriseadmete osas on kogu PCR-protsessi keskmes järgmine ensüüm:

Taq polümeraas

See on ensüüm, mis on saadud mikroorganismilt "Thermus aquarius" (Taq) - bakteritüvest, mis eksisteerib kuumade vulkaaniliste allikate läheduses ja suudab oma keskkonna kõrgetele temperatuuridele kohanedes ellu jääda.

Taq polümeraasi eripära on see, et see ensüüm suudab oma funktsiooni täita ka kõrgel temperatuuril üle 50 ° C - nimelt

DNA korrutamine ("amplifikatsioon")

Lisaks Taq polümeraasile tuleb enne PCR-analüüsi täpselt määratleda, millist DNA osa uuritakse. Selleks vajate lühikesi DNA fragmente, mille peen struktuur vastab vastava geneetilise koodi (“DNA järjestus”) osas DNA sihtpiirkonnale. Neid DNA fragmente nimetatakse

"Aabits" helistas

Tegelik amplifikatsiooniprotsess PCR-i kontekstis sisaldab lõpuks järgmisi samme:

  • Geneetilise materjali (DNA või RNA) ekstraheerimine testmaterjalist.

    RNA analüüsimisel tuleb ribonukleiinhappe koodijärjestus kõigepealt muuta DNA koodijärjestuseks, mis tuleb enne tegelikku amplifikatsiooni teha analüüsietapis ensüümiga "pöördtranskriptaas"

  • Geneetilise materjali amplifitseerimine mitmes etapis (tsüklid):

    • Esimene etapp - "DNA denatureerimine": kaheahelalise DNA kuumutamisel (95 ° C) sulatatakse see üksikuteks ahelateks.
    • Teine etapp - “lõõmutamine”: madalamal temperatuuril (umbes 55 ° C) saavad “praimerid” nüüd kinnituda oma DNA sihtjärjestuste külge.
    • Kolmas etapp - pikenemine: temperatuuril 72 ° C pikendab (pikendab) ensüüm Taq polümeraas praimeri algjärjestust, kasutades nn "nukleotiide" (need on DNA ehituskivid) ja ehitab selle üles sel moel uus piklik DNA molekul.

Kuna etappe üks kuni kaks korratakse mitmes tsüklis, tekivad järjest pikemad ja uuesti moodustunud DNA-ahelad, millest tuleneb selle laboriprotsessi nimi “polümeraasi ahelreaktsioon”.

  • Äsja loodud DNA-ahelate (nn PCR-tooted) analüüs:

    Ahelreaktsiooni (tsüklite) lõpus uuritakse ja hinnatakse PCR saadusi - st vastloodud DNA molekule - kvalitatiivselt või kvantitatiivselt. Selle hindamise enda jaoks on arvukalt võimalusi, mis põhinevad peamiselt DNA värvimisel (eriti fluorestsentsvärvidel) ja selle nähtavaks tegemisel (geelelektroforeesi või fotomeetrilise fluorestsentsi tuvastamise abil)

Milliseid testitulemusi PCR annab?

Kaasaegsete PCR-meetodite tulemused võib kokku võtta kahes rühmas:

  • kvalitatiivne ja
  • kvantitatiivsed tulemused.

Kvalitatiivses PCR-is uuritakse, kas testimaterjalis on teatud osa geneetilisest materjalist (DNA või RNA) (positiivne tulemus) või mitte (negatiivne tulemus).

Kvalitatiivset PCR-i kasutatakse seetõttu peamiselt järgmiste diagnostiliste küsimuste ("jah / ei" tulemused) selgitamiseks:

  • Pärilike haiguste diagnoosimine,
  • Mutatsioonide selgitamine,
  • Geneetiliste omaduste äratundmine (nt eelsoodumus teatud haiguste korral) jne.

Kvantitatiivne PCR on selle laborimeetodi edasiarendus, mille käigus tuvastatakse mitte ainult geneetilise materjali teatud ala olemasolu, vaid ka geneetilise materjali kogus. Seetõttu kasutatakse kvantitatiivset PCR-i peamiselt järgmistes meditsiinivaldkondades:

  • Infektsioonidiagnoosi osana saab täpselt kindlaks määrata patogeenide hulga patsiendi kehas. Viirusnakkuste korral kasutatakse seda PCR-meetodit nn

    Uuritud viiruskoormus

Lisaks on kvantitatiivne PCR väga oluline ka alusuuringutes, kusjuures sellest protsessist võidavad mitte ainult inimmeditsiin, vaid ka mitmed muud teadusvaldkonnad (veterinaarmeditsiin, biokeemia, bioloogia jne).

PCR-i eelis nakkushaiguste diagnoosimisel on see, et selle laborimeetodi testitulemused on ülimalt kiiresti kättesaadavad (tavaliselt ühe tööpäeva jooksul). Lisaks on PCR ülitundlik laborimeetod. See tähendab, et isegi väikseimad bakterite või viiruste kogused uuritavas materjalis toovad usaldusväärselt positiivse tulemuse.

Kas tavapärases PCR-is on veel arenguid?

PCR metoodika eriline edasiarendus on

Multipleksne PCR

Multipleksses PCR-s kasutatakse korraga mitut DNA sihtjärjestust (loe: mitu praimerit). See loob segu PCR-produktidest, mis tuleb vastavalt tuvastada ja hinnata.

Multipleksset PCR-i kasutatakse ka peamiselt meditsiinis

  • inimese geneetika samuti
  • nakkuse diagnoos.

Selle meetodi eeliseks on see, et patsientidelt tuleb hankida vähem uuritavat materjali ja ühe analüüsi etapina saab luua rea testitulemusi. Kuid need eelised diagnostika osas kompenseeritakse paljudel juhtudel kõrge analüüsihinnaga.

Teine PCR-i kasutamise eripära on PCR-i laboriprotsess

DNA järjestamine

See on diagnostiline võimalus patsiendi geneetilise koodi täpse järjestuse dešifreerimiseks. Järjestuse määramise meetod võib põhineda ka PCR-tehnoloogial.

Kuna aga järjestamine on tavapärastest PCR-meetoditest oluliselt keerukam ja kulukam, on see praegu reserveeritud spetsiaalsete diagnostiliste (laiendatud genoomianalüüside) ja teaduslike küsimuste jaoks.

Millised on PCR-i peamised kasutusvaldkonnad?

PCR-i rakendusvaldkondade osas inimmeditsiinis kasutatakse seda laboriprotseduuri järgmiste diagnostiliste küsimuste jaoks:

  • Pärilike haiguste täpsustamine - juba on olemas PCR-meetodid enam kui 600 erineva päriliku haiguse jaoks.
  • Farmakogeneetika - maksa ainevahetuse geneetilisi omadusi uurides saab teha järeldusi ravimite efektiivsuse ja annustamise kohta.
  • Kasvajaravim ("onkoloogia") - siin kasutatakse ühelt poolt PCR-i teatud kasvajahaiguste (nt rinnavähk) riskifaktorite selgitamiseks. Teisest küljest saab kasvajate rakke ja kudesid uurida ka erinevate mutatsioonide osas, mis mängib üha olulisemat rolli just nende haiguste ravis.
  • Kohtuekspertiisi meditsiin ("kohtuekspertiisi") - siin PCR on väga oluline, näiteks isaduse menetluses ja kriminoloogia ("DNA sõrmejälgede").
  • Infektsiooniravim - PCR-il on asendamatu väärtus bakteriaalsete, viiruslike ja parasiitiliste nakkushaiguste diagnoosimisel, progresseerumisel ja teraapia kontrollimisel.

Vähi kohta lisateabe saamiseks vaadake jaotist Vähk.

Kas PCR-testi tulemuste jaoks on olemas võrdlusväärtused?

PCR-meetodite kontrollväärtuste osas tuleb alati arvestada vastava diagnostikaküsimusega. Kuna pärilike haiguste uurimise käigus (nt mutatsioonianalüüs) tuvastatakse teatud geneetilised tunnused, puudub sellistes laboratoorsetes analüüsides võrdlusväärtus („positiivne“või „negatiivne“), nagu puudub ka näiteks juuksevärvi võrdlusväärtus. Sest juuksevärv on ka geneetiline omadus.

Lisaks kehtivad selles riigis kaasasündinud pärilike tunnuste laborianalüüsid rangete eeskirjadega, mille puhul on Austria geenitehnoloogia seaduse (GTG) sätted autoriteetsed (olemasoleva haiguse määramine vastavalt GTG §-le 65). Seetõttu võib meditsiinilabor selle analüüsi läbi viia alles pärast uuritava isiku, vanema või seadusliku eestkostja (alaealiste puhul, kes pole võimelised otsust tegema) või seadusliku esindaja (vanuses isikute puhul, kes pole võimelised otsustama) kirjalikku kinnitust tervishoiuteenuse pakutava teabe kohta. selle geneetilise testi osas tuleb läbi viia raviarst (GTG artikkel 69).

Lisaks on patsientidel üldiselt õigus keelata geneetiliste testide läbiviimine iseendaga.

Mitte-inimese geneetilise PCR laboratoorsete analüüside puhul kehtivad siiski palju vähem ranged regulatsioonid. Enamasti puudutab see nakkusdiagnoosimise valdkonna laborimeetodeid.

Nende laborimeetodite kontrollväärtuste osas tuleb eristada kvalitatiivseid ja kvantitatiivseid meetodeid:

Kvalitatiivsed PCR-meetodid annavad tavaliselt positiivse või negatiivse tulemuse, kusjuures negatiivne on tavaliselt kontrollväärtus

Kvantitatiivse PCR-meetodi abil määratakse meetodist sõltuvalt sobivad piirväärtused (nn piirväärtused), millest alates tuleb tulemust hinnata patoloogiliseks.

Soovitatav: